張鋒最新Nature論文：借助AlphaFold，改造出全新蛋白質(zhì)定向遞送系統(tǒng)

作者|生物世界 來源|生物世界(ID：ibioworld)

如果把細胞比作是精密的機械鐘表，那么蛋白質(zhì)就是其內(nèi)部大大小小的齒輪，它們是生命活動的主要執(zhí)行者，發(fā)揮著生命基石般的關(guān)鍵作用。而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是其功能的基礎(chǔ)，如果我們能任意改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，那么就能自由控制其功能，其潛在應(yīng)用無疑非常巨大。

要想實現(xiàn)這一點，準確預測或解析蛋白質(zhì)的三維空間構(gòu)象是關(guān)鍵第一步。在過去，想要確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不僅困難而且耗時耗力。而隨著人工智能（AI）技術(shù)的發(fā)展，DeepMind公司開發(fā)的AlphaFold，能夠僅依據(jù)蛋白質(zhì)序列信息，就能快速準確預測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，其強大的能力受到越來越多的關(guān)注和應(yīng)用。

2023年3月29日，CRISPR基因編輯先驅(qū)張鋒教授及其團隊在 Natrue 期刊發(fā)表了題為：Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system 的研究論文。

在這項最新研究中，張鋒團隊通過AlphaFold輔助蛋白質(zhì)設(shè)計開發(fā)了一種蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)——改造、利用獨特的細菌“注射器”將蛋白質(zhì)注射到人類細胞中。這種新型蛋白質(zhì)遞送方式或?qū)⒏淖兓蛑委煛┌Y治療等前沿療法格局，具有強大的應(yīng)用前景。

內(nèi)共生細菌是一類特殊的細菌，它們可以寄生在宿主細胞的內(nèi)部，并已然進化出復雜的傳遞系統(tǒng)使其分泌調(diào)節(jié)宿主細胞的生物因子。例如，細胞外可收縮注射系統(tǒng)（eCIS），正是這樣一種類似于“注射器”的大分子復合物。eCIS通過驅(qū)動一個“針頭”結(jié)構(gòu)穿透細胞膜，然后將攜帶的蛋白質(zhì)有效載荷注入到真核細胞中。

eCIS廣泛分布在細菌和古菌中，并已被證明具有多種天然功能，包括調(diào)節(jié)宿主細胞骨架、DNA切割，誘導變形運動和產(chǎn)生宿主毒性。最近，有研究發(fā)現(xiàn)eCIS可以靶向小鼠細胞，這就提高了eCIS作為蛋白質(zhì)遞送工具的可能性。

然而，eCIS的活性尚未在人類細胞中得到證實，如果想要將eCIS開發(fā)為靶向遞送系統(tǒng)，就要先闡明eCIS識別靶細胞的機制。

在這項最新研究中，張鋒團隊首先選定了eCIS的一個亞型——Photorhabdus virulence cassette（PVC）。PVC由一個約20kb的操縱子組成，包含16個核心基因（pvc1-16），以及下游的有效載荷Pdp1和Pnf。研究團隊發(fā)現(xiàn)，PVC有效載荷蛋白的N端高度無序區(qū)域是其“包裝結(jié)構(gòu)域”，只要將其與想要遞送的蛋白（例如GFP）融合，就能將其加載到PVC復合體中。

PVC系統(tǒng)可以被重新編程以在真核細胞中定制蛋白遞送

值得注意的是，除了N端高度無序區(qū)域之外，Pvc13（尾纖維蛋白）和Pvc15（一種ATP酶）也是該遞送系統(tǒng)成功的關(guān)鍵。其中，Pvc13可能參與了PVC復合體的靶標識別，并可用于操縱PVC復合體的靶標特異性。

基于此，研究團隊使用AlphaFold預測Pvc13的三維結(jié)構(gòu)，當將其作為三聚體時，Pvc13的C端形成了一個預測的螺旋管結(jié)構(gòu)和一個球狀的尖端結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究團隊由此假設(shè)，改變Pvc13的這個尖端結(jié)合域的結(jié)構(gòu)特征可能會導致PVC的靶向性發(fā)生可預測的變化。

AlphaFold預測和改造Pvc13，以改變PVC系統(tǒng)的宿主細胞靶向性

為了驗證這一點，研究團隊將針對人類細胞的結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Ad5-knob和E01-DARPin）插入到Pvc13的C端結(jié)合域，并測試由此產(chǎn)生的PVC復合體是否可以靶向人類細胞。結(jié)果顯示，改造后的PVC可以有效殺死A549細胞（攜帶毒性基因）或高效表達GFP（融合蛋白）。

這些結(jié)果表明，Pvc13是PVC復合體的一個靶向性決定元件，該蛋白可以被修飾，從而靶向特定的細胞系。

PVC介導的蛋白遞送具有高度特異性

進一步研究顯示，改造后的PVC復合體還可以自由裝載spCas9、鋅指脫氨酶（ZFD）以及細胞毒素等不同的效應(yīng)元件，前兩者分別實現(xiàn)對靶細胞DNA的基因編輯和不依賴RNA的基因編輯，后者則可以靶向清除癌細胞、衰老細胞等有害細胞。

改造后的PVC系統(tǒng)可以靶向遞送多種效應(yīng)元件

不僅如此，為了驗證PVC遞送系統(tǒng)在活體動物中的效果，張鋒團隊再次使用AlphaFold引導Pvc13的工程化設(shè)計，并篩選到兩種靶向小鼠細胞的PVC系統(tǒng)——Pcc-13-Ad5-knob（RGD/PK7）和Pvc13-Anti-MHCII Nb。與預期一致，前者表現(xiàn)出較為廣泛的趨向性（正如Ad5 RGD/PK7病毒感染那樣），而后者則對MHC+免疫細胞表現(xiàn)出強烈的偏好性。

張鋒團隊還發(fā)現(xiàn)，PVC治療沒有產(chǎn)生任何顯著的免疫細胞激活、炎癥細胞因子產(chǎn)生、體重損失或細胞毒性，這表明PVC治療在實驗過程中沒有產(chǎn)生免疫原性或毒性。此外，PVC治療七天后就無法從小鼠大腦中檢測到PVC相關(guān)蛋白，這表明PVC遞送系統(tǒng)僅在大腦中短暫停留，不會持續(xù)太長時間。

重編程的PVC系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)靶向遞送

總的來說，這些結(jié)果表明，PVC系統(tǒng)經(jīng)過改造后可以在細胞和體內(nèi)靶向遞送蛋白質(zhì)，并在基因編輯、癌癥治療和臨床靶向遞送等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，未來可能成為許多生物療法的關(guān)鍵遞送工具。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41586-023-05870-7

編者按：本文轉(zhuǎn)載自微信公眾號：生物世界(ID：ibioworld)，作者：生物世界