張鋒最新Nature論文：借助AlphaFold，改造出全新蛋白質(zhì)定向遞送系統(tǒng)

作者|生物世界 來(lái)源|生物世界(ID：ibioworld)

如果把細(xì)胞比作是精密的機(jī)械鐘表，那么蛋白質(zhì)就是其內(nèi)部大大小小的齒輪，它們是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者，發(fā)揮著生命基石般的關(guān)鍵作用。而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是其功能的基礎(chǔ)，如果我們能任意改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，那么就能自由控制其功能，其潛在應(yīng)用無(wú)疑非常巨大。

要想實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)或解析蛋白質(zhì)的三維空間構(gòu)象是關(guān)鍵第一步。在過(guò)去，想要確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不僅困難而且耗時(shí)耗力。而隨著人工智能（AI）技術(shù)的發(fā)展，DeepMind公司開(kāi)發(fā)的AlphaFold，能夠僅依據(jù)蛋白質(zhì)序列信息，就能快速準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)大的能力受到越來(lái)越多的關(guān)注和應(yīng)用。

2023年3月29日，CRISPR基因編輯先驅(qū)張鋒教授及其團(tuán)隊(duì)在 Natrue 期刊發(fā)表了題為：Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system 的研究論文。

在這項(xiàng)最新研究中，張鋒團(tuán)隊(duì)通過(guò)AlphaFold輔助蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)——改造、利用獨(dú)特的細(xì)菌“注射器”將蛋白質(zhì)注射到人類(lèi)細(xì)胞中。這種新型蛋白質(zhì)遞送方式或?qū)⒏淖兓蛑委煛┌Y治療等前沿療法格局，具有強(qiáng)大的應(yīng)用前景。

內(nèi)共生細(xì)菌是一類(lèi)特殊的細(xì)菌，它們可以寄生在宿主細(xì)胞的內(nèi)部，并已然進(jìn)化出復(fù)雜的傳遞系統(tǒng)使其分泌調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生物因子。例如，細(xì)胞外可收縮注射系統(tǒng)（eCIS），正是這樣一種類(lèi)似于“注射器”的大分子復(fù)合物。eCIS通過(guò)驅(qū)動(dòng)一個(gè)“針頭”結(jié)構(gòu)穿透細(xì)胞膜，然后將攜帶的蛋白質(zhì)有效載荷注入到真核細(xì)胞中。

eCIS廣泛分布在細(xì)菌和古菌中，并已被證明具有多種天然功能，包括調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞骨架、DNA切割，誘導(dǎo)變形運(yùn)動(dòng)和產(chǎn)生宿主毒性。最近，有研究發(fā)現(xiàn)eCIS可以靶向小鼠細(xì)胞，這就提高了eCIS作為蛋白質(zhì)遞送工具的可能性。

然而，eCIS的活性尚未在人類(lèi)細(xì)胞中得到證實(shí)，如果想要將eCIS開(kāi)發(fā)為靶向遞送系統(tǒng)，就要先闡明eCIS識(shí)別靶細(xì)胞的機(jī)制。

在這項(xiàng)最新研究中，張鋒團(tuán)隊(duì)首先選定了eCIS的一個(gè)亞型——Photorhabdus virulence cassette（PVC）。PVC由一個(gè)約20kb的操縱子組成，包含16個(gè)核心基因（pvc1-16），以及下游的有效載荷Pdp1和Pnf。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，PVC有效載荷蛋白的N端高度無(wú)序區(qū)域是其“包裝結(jié)構(gòu)域”，只要將其與想要遞送的蛋白（例如GFP）融合，就能將其加載到PVC復(fù)合體中。

PVC系統(tǒng)可以被重新編程以在真核細(xì)胞中定制蛋白遞送

值得注意的是，除了N端高度無(wú)序區(qū)域之外，Pvc13（尾纖維蛋白）和Pvc15（一種ATP酶）也是該遞送系統(tǒng)成功的關(guān)鍵。其中，Pvc13可能參與了PVC復(fù)合體的靶標(biāo)識(shí)別，并可用于操縱PVC復(fù)合體的靶標(biāo)特異性。

基于此，研究團(tuán)隊(duì)使用AlphaFold預(yù)測(cè)Pvc13的三維結(jié)構(gòu)，當(dāng)將其作為三聚體時(shí)，Pvc13的C端形成了一個(gè)預(yù)測(cè)的螺旋管結(jié)構(gòu)和一個(gè)球狀的尖端結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究團(tuán)隊(duì)由此假設(shè)，改變Pvc13的這個(gè)尖端結(jié)合域的結(jié)構(gòu)特征可能會(huì)導(dǎo)致PVC的靶向性發(fā)生可預(yù)測(cè)的變化。

AlphaFold預(yù)測(cè)和改造Pvc13，以改變PVC系統(tǒng)的宿主細(xì)胞靶向性

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)將針對(duì)人類(lèi)細(xì)胞的結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Ad5-knob和E01-DARPin）插入到Pvc13的C端結(jié)合域，并測(cè)試由此產(chǎn)生的PVC復(fù)合體是否可以靶向人類(lèi)細(xì)胞。結(jié)果顯示，改造后的PVC可以有效殺死A549細(xì)胞（攜帶毒性基因）或高效表達(dá)GFP（融合蛋白）。

這些結(jié)果表明，Pvc13是PVC復(fù)合體的一個(gè)靶向性決定元件，該蛋白可以被修飾，從而靶向特定的細(xì)胞系。

PVC介導(dǎo)的蛋白遞送具有高度特異性

進(jìn)一步研究顯示，改造后的PVC復(fù)合體還可以自由裝載spCas9、鋅指脫氨酶（ZFD）以及細(xì)胞毒素等不同的效應(yīng)元件，前兩者分別實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞DNA的基因編輯和不依賴(lài)RNA的基因編輯，后者則可以靶向清除癌細(xì)胞、衰老細(xì)胞等有害細(xì)胞。

改造后的PVC系統(tǒng)可以靶向遞送多種效應(yīng)元件

不僅如此，為了驗(yàn)證PVC遞送系統(tǒng)在活體動(dòng)物中的效果，張鋒團(tuán)隊(duì)再次使用AlphaFold引導(dǎo)Pvc13的工程化設(shè)計(jì)，并篩選到兩種靶向小鼠細(xì)胞的PVC系統(tǒng)——Pcc-13-Ad5-knob（RGD/PK7）和Pvc13-Anti-MHCII Nb。與預(yù)期一致，前者表現(xiàn)出較為廣泛的趨向性（正如Ad5 RGD/PK7病毒感染那樣），而后者則對(duì)MHC+免疫細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的偏好性。

張鋒團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，PVC治療沒(méi)有產(chǎn)生任何顯著的免疫細(xì)胞激活、炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生、體重?fù)p失或細(xì)胞毒性，這表明PVC治療在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生免疫原性或毒性。此外，PVC治療七天后就無(wú)法從小鼠大腦中檢測(cè)到PVC相關(guān)蛋白，這表明PVC遞送系統(tǒng)僅在大腦中短暫停留，不會(huì)持續(xù)太長(zhǎng)時(shí)間。

重編程的PVC系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶向遞送

總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，PVC系統(tǒng)經(jīng)過(guò)改造后可以在細(xì)胞和體內(nèi)靶向遞送蛋白質(zhì)，并在基因編輯、癌癥治療和臨床靶向遞送等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，未來(lái)可能成為許多生物療法的關(guān)鍵遞送工具。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41586-023-05870-7

編者按：本文轉(zhuǎn)載自微信公眾號(hào)：生物世界(ID：ibioworld)，作者：生物世界