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2024年酶的定向進(jìn)化技術(shù)發(fā)展趨勢(shì) 人工智能帶動(dòng)技術(shù)發(fā)展【組圖】

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20 廖子璇 ? 2024-02-28 14:09:13  來源:前瞻產(chǎn)業(yè)研究院 E6232G0

行業(yè)主要上市公司:金斯瑞(HK.1548)、凱賽生物(688065.SH)、華熙生物(688363.SH)、華恒生物(688639.SH)、川寧生物(301301.SZ)等

本文核心數(shù)據(jù):酶的定向進(jìn)化原理;高效構(gòu)建突變體庫(kù)的新方法;體外突變發(fā);體內(nèi)突變法;高通量定向進(jìn)化的新方法

——酶的定向進(jìn)化原理

酶的定向進(jìn)化,旨在試管中模擬自然進(jìn)化過程,通過提高基因突變率和設(shè)計(jì)特殊的篩選、選擇方法,快速獲得擁有特定性能的酶。因此,定向進(jìn)化又被稱為“代替自然選擇的上帝之手”,為試管中的達(dá)爾文主義。酶的定向進(jìn)化通常包括三個(gè)步驟:①通過對(duì)蛋白編碼序列進(jìn)行隨機(jī)突變、定點(diǎn)突變或重組構(gòu)建基因突變體庫(kù);②定向篩選、選擇以獲得具有改進(jìn)表型的突變體;③以該突變體作為下一輪基因多樣化的起點(diǎn),進(jìn)行定向進(jìn)化的迭代,直到獲得性能最優(yōu)的突變體。

圖表1:蛋白質(zhì)定向進(jìn)化原理

根據(jù)文庫(kù)構(gòu)建原理的不同,蛋白質(zhì)定向進(jìn)化可分為隨機(jī)進(jìn)化、半理性進(jìn)化和理性進(jìn)化三種策略,其大致思路均為由某一靶基因或一族相關(guān)的家族基因起始,通過對(duì)編碼基因進(jìn)行突變或重組,創(chuàng)建分子多樣性文庫(kù);篩選文庫(kù)獲得能夠編碼改進(jìn)性狀的基因,作為下一輪進(jìn)化的模板;在短時(shí)間內(nèi)完成自然界中需要成千上萬年的進(jìn)化,從而獲得具有改進(jìn)功能或全新功能的蛋白質(zhì)。

圖表2:蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的最新方法、優(yōu)勢(shì)及存在的問題

——高效構(gòu)建突變體庫(kù)的新方法

高效構(gòu)建多樣化的基因突變體庫(kù)是定向進(jìn)化的關(guān)鍵步驟之一。早期通過化學(xué)試劑(如甲磺酸乙酯、亞硝酸等)或射線對(duì)基因進(jìn)行無差別隨機(jī)突變的傳統(tǒng)方法,由于突變率低并且極易造成基因組不穩(wěn)定而逐漸被淘汰。取而代之的是一系列相對(duì)可控且有高突變率的體外突變法和體內(nèi)突變法。

——體外突變法

體外突變法主要包括可以產(chǎn)生隨機(jī)突變的易錯(cuò)PCR(error-prone PCR, epPCR)、DNA改組(DNA shuffling)、可以產(chǎn)生非隨機(jī)突變的定點(diǎn)飽和突變(site-saturation mutagenesis, SSM)、序列飽和突變(sequence saturation mutagenesis, SeSaM)、合成文庫(kù)(synthetic library generation)等,這些傳統(tǒng)體外突變技術(shù)成為單個(gè)酶定向進(jìn)化的有力工具,隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,構(gòu)建體外突變體庫(kù)的新方法也不斷涌現(xiàn)。

圖表3:體外突變法的類別

此外,隨著基因高通量合成技術(shù)及DNA測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展,傳統(tǒng)的體外突變法存在的共有缺陷,如密碼子缺乏控制、具有序列偏好性等,在一定程度上被合成文庫(kù)法所改善。Twist Bioscience公司與M. Reetz課題組合作,在2018年報(bào)道了這種新型的體外突變體庫(kù)構(gòu)建方法,即在硅基芯片上應(yīng)用大規(guī)模平行寡核苷酸合成技術(shù),然后進(jìn)行有效的基因組裝,每種突變體均采用計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì),并在合成前進(jìn)行篩選,因此消除了不需要的序列偏倚、提前出現(xiàn)的終止密碼子和多余的基序。通過實(shí)驗(yàn)分析,這種通過大規(guī)?;蚝铣蓸?gòu)建突變體庫(kù)的方法相比于利用傳統(tǒng)的易錯(cuò)PCR或飽和突變等方法,具有野生型序列更少、突變體分布比例更均勻、文庫(kù)多樣性更豐富等突出優(yōu)勢(shì),有利于下游篩選,目前,該方法已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。

——體內(nèi)突變法

基因突變體庫(kù)的另一大類構(gòu)建方法是體內(nèi)突變法,即在胞內(nèi)誘導(dǎo)特定基因的突變,無需進(jìn)行基因克隆與轉(zhuǎn)化,很大程度上縮短了定向進(jìn)化的實(shí)驗(yàn)周期。例如早期開發(fā)的基于單鏈DNA重組的多元自動(dòng)化基因組工程技術(shù)(multiplex automated genome engineering, MAGE),是針對(duì)大腸桿菌基因組上特定基因進(jìn)行體內(nèi)誘變的重要策略。近年來,CRISPR-Cas介導(dǎo)的重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在原核與真核細(xì)胞中對(duì)目的基因進(jìn)行高效的片段插入、刪除和替換,大大提高了原核與真核細(xì)胞中重組的效率,因此也發(fā)展了一批高效的胞內(nèi)蛋白質(zhì)定向進(jìn)化工具。例如將CRISPR-Cas系統(tǒng)和MAGE整合后,基因重組效率由3%提高到98%,插入/替換效率提高至70%;將CRISPR-Cas9與epPCR偶聯(lián)(CasPER)可以向酵母基因組中任意基因的600 bp內(nèi)引入隨機(jī)突變。

圖表4:基于CRISPR的體內(nèi)突變方法

注:a—基于CRISPR-CAS9同源重組的突變;b—基于NCAS9和DNA聚合酶I的突變;c—基于NCAS9和堿基編輯器的突變

——高通量定向進(jìn)化的新方法

創(chuàng)建序列覆蓋率高、多樣性強(qiáng)的突變體庫(kù),能最大程度挖掘不同氨基酸序列與其對(duì)應(yīng)表型之間的關(guān)系,理論上能夠提高獲得理想突變體的概率。然而,絕大部分篩選和選擇技術(shù)通量低、準(zhǔn)確性差,導(dǎo)致難以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)序列全面且深入的挖掘。因此,開發(fā)更快速、靈敏、準(zhǔn)確的高通量篩選技術(shù),是提高定向進(jìn)化效率的關(guān)鍵所在。

——新型高通量篩選技術(shù)

在酶分子的定向進(jìn)化過程中,突變體庫(kù)的高質(zhì)量以及高通量篩選方法的可靠性,通常是決定其成敗的關(guān)鍵性因素。根據(jù)是否需要篩選標(biāo)記可以將目前普遍應(yīng)用的高通量篩選方法分為兩大類,其中需要標(biāo)記的技術(shù)為平板篩選法、展示法和熒光篩選法,不需要標(biāo)記的技術(shù)為質(zhì)譜法、紅外檢測(cè)法和特殊光譜檢測(cè)法,以下著重對(duì)這些方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

圖表5:主要新型高通量篩選技術(shù)介紹

——連續(xù)定向進(jìn)化

連續(xù)進(jìn)化旨在無人為干預(yù)的情況下完成基因突變、蛋白表達(dá)、表型選擇與篩選的迭代實(shí)驗(yàn)。連續(xù)定向進(jìn)化通過縮短每輪的進(jìn)化時(shí)間來增加迭代次數(shù),從而提高獲得目標(biāo)性狀突變體的概率。由D. Liu課題組開發(fā)的噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)(phage-assisted continuous evolution, PACE)是較經(jīng)典的案例。PACE將目標(biāo)蛋白編碼序列引入篩選噬菌體DNA載體中(selection phage, SP),并通過敲除pⅢ蛋白編碼區(qū)而阻斷噬菌體侵染力,同時(shí)將含有pⅢ的輔助質(zhì)粒(accessory plasmid, AP)和提高大腸桿菌基因突變率的突變質(zhì)粒(mutator plasmid, MP)引入大腸桿菌內(nèi)。通過設(shè)計(jì)特定的基因回路,將pⅢ的表達(dá)與目標(biāo)蛋白的活性相偶聯(lián),再通過類似“潟湖”的液路控制系統(tǒng)使得含有目標(biāo)活性突變體的噬菌體迭代富集,從而實(shí)現(xiàn)進(jìn)化與篩選自動(dòng)循環(huán)。由于從噬菌體侵染到再組裝的周期較為短暫,因此PACE系統(tǒng)可以在24 h內(nèi)完成30輪以上的蛋白質(zhì)進(jìn)化,達(dá)到其他定向進(jìn)化手段難以企及的迭代次數(shù)。

圖表6:噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化過程

——計(jì)算機(jī)輔助的定向進(jìn)化

近年來隨著人工智能的高速發(fā)展,借助同源建模與機(jī)器學(xué)習(xí)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性日益增加,不同的算法及軟件被開發(fā)以用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計(jì)算。包括Modeller、Rosetta、AlphaFold 2等在內(nèi)的多種方法已被廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。其中,最廣為人知的計(jì)算方法為AlphaFold 2,這種算法是通過生物信息學(xué)和物理方法結(jié)合的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖表7:AlphaFold 2計(jì)算原理示意圖

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作者 廖子璇
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